Yn y broses o gynnal astudiaethau genetig, rydym yn aml yn dod ar draws samplau RNA annigonol, er enghraifft, ar gyfer astudio tiwmorau geneuol anatomegol bach, hyd yn oed samplau un-gell, a samplau o fwtaniadau genynnol penodol sy'n cael eu trawsgrifio ar lefelau isel iawn mewn celloedd dynol.Wrth gwrs, ar gyfer y prawf COVID-19, os nad yw'r swabiau yn y lle iawn neu ddim digon o weithiau yn ystod y samplu, bydd maint y sampl yn isel iawn, a dyna pam y daeth y Comisiwn Iechyd a Chynllunio Teuluol allan ddau ddiwrnod yn ôl a wedi pasio'r prawf, ac os na chymerodd y samplwr asid niwclëig chwe sampl, gallwch roi gwybod amdano.
Mae sensitifrwydd yr adweithydd yn bwysig oherwydd bod gennym y broblem hon neu'r broblem honno, felly beth allwn ni ei wneud i wella sensitifrwydd RT-PCR?
Cyn inni drafod atebion posibl, gadewch i ni sôn am ddau gymhlethdod mawr gyda'r sefyllfa yr ydym newydd ei chrybwyll.
Yn gyntaf oll, rydym yn poeni am golled RNA pan nad oes gennym ond ychydig o boblogaethau celloedd yn ein sampl.Os defnyddir dulliau gwahanu a glanhau traddodiadol, megis dull colofn neu ddull dyddodiad asid niwclëig, mae posibilrwydd uchel y bydd yr ychydig samplau yn cael eu colli.Un ateb yw ychwanegu moleciwl cludo, fel tRNA, ond hyd yn oed wedyn, nid oes unrhyw sicrwydd bod ein harbrawf adfer yn iawn.
Felly beth yw ffordd well?Opsiwn da ar gyfer celloedd diwylliedig neu samplau microanatomegol yw defnyddio lysis uniongyrchol.
Y syniad yw hollti'r celloedd am 5 munud, rhyddhau'r RNA i'r ateb, yna atal yr adwaith am 2 funud, yna ychwanegu'r lysate yn uniongyrchol i'r adwaith trawsgrifio gwrthdro fel nad oes unrhyw RNA yn cael ei golli, ac yn olaf rhowch y cDNA canlyniadol yn uniongyrchol i mewn i'r adwaith amser real.
Ond beth os, oherwydd man cychwyn cyfyngedig neu ychydig o fynegiant genynnau targed, y gallwn ailgylchu'r holl RNA a dal i beidio â darparu digon o dempledi i gael signal amser real da?
Yn yr achos hwn, gall y cam cyn ymhelaethu fod yn ddefnyddiol iawn.
Mae'r canlynol yn gynllun i gynyddu sensitifrwydd ar ôl trawsgrifio o chwith.Cyn dechrau, mae angen i ni ofyn i lawr yr afon pa dargedau y mae gennym ddiddordeb ynddynt, er mwyn dylunio paent preimio penodol ar gyfer y targedau hyn ar gyfer rhag-ymhelaethu.
Gellir cyflawni hyn trwy greu paent preimio cymysg gyda hyd at 100 pâr o breimwyr a chylch adwaith o 10 i 14 gwaith.Felly, mae angen Meistr Cymysgedd a ddyluniwyd yn benodol ar gyfer y gofyniad hwn i gynyddu'r cDNA a gafwyd ymlaen llaw.
Y rheswm dros osod nifer y cylchoedd rhwng 10 a 14 yw bod y nifer gyfyngedig hon o gylchoedd yn sicrhau hap rhwng y gwahanol dargedau, sy'n hanfodol i ymchwilwyr sydd angen gwybodaeth moleciwlaidd meintiol.
Ar ôl ymhelaethu ymlaen llaw, gallwn gael llawer iawn o cDNA, fel bod y sensitifrwydd canfod yn y pen ôl yn gwella'n fawr, a gallwn hyd yn oed wanhau'r sampl a pherfformio adweithiau PCR amser real lluosog i ddileu gwallau ar hap posibl.
Amser post: Ebrill-11-2023